PEWARNAAN SLIDE MALARIA

Rasional:   Sediaan darah yang sudah diwa rnai sangat penting untuk
menentukan diagnosa dan identifikasi sp esies malaria.

Alat dan Bahan

A.  Alat 
          Rak Staining
          Catatan: Rak Coplin   atau kontainer lain dapat dipa kai untuk pewarnaan
          slide dalam  satu batch.

B. Bahan : 
        1. Pewarna Giemsa (di buat dari cairan stok )
        2. Methanol absolut
        3. Pipet sekali pakai
        4. Air minur komersial yang tersedia

Persiapan 

  1. Cairan Giemsa stok:
       8 gr bubuk  Giemsa (tidak boleh mengkristal )
       500 ml methanol absolut
       500 ml glyserin murni

  2. Pewarna Giemsa: (10%  atau pengenceran 1: 10)
        10 ml cairan Giemsa stok
        90 ml air minum botolan, pH = 7.0 – 7.2
  Catatan: La ma pewarnaan untuk pengen ceran 10% adalah 25 me nit. Siapkan cairan baru yang telah di       encerkan untuk setiap kali proses pewarnaan. Pewarna Giemsa yang su dah diencerkan ti dak  bo leh           diguna kan lebih dari 3 jam.

Pembu atan  cairan Giemsa standar:
   1.  Gunakan tabung Erlenmeyer bersih dan kering seca ra kimiawi, atau botol
         polyethylee
   2.   Gunakan pengaduk magnet tabung Erlenmeyer
   3.   Tuangkan 500 ml methanol.
   4.   Perlahan tambahkan sesendok-sesend ok bubuk pewarna sampai  mencapai
         jumlah yan g diinginkan (8 gr bubuk Giemsa).
   5.   Gunakan kertas alumunium untuk menutup campuran ini selama proses
         berlangsung.
   6.   Biarkan bu buk pewarna larut secara   perl ahan dalam methanol dan biarkan pengaduk magnet                    berputar melarutkan bu buk Giemsa dalam methanol. Tambahkan 500 ml glyserol dan terusk an                    proses pengadukan.  Lanjutkan  proses pen gadukan ini selama 6 jam.
   7.   Diamkan selama 8 jam  atau semalaman.
   8.   Aduk cairan ini setelah 8 jam atau semalaman samp ai tercampur dengan sempurna.
   9.    Saring menggunakan kertas saring Whatman dan simpan cairan Giemsa standar ini dalam botol hitam             (atau gunakan kertas alumunium untuk membungk us botol).
  10. Beri label pada botol dengan tulisan tanggal pembuatan. Botol ditutup kencang dan disimpan ditempat           yang dingin dan terhindar dari sinar matahari langsung. Cairan ini dapat dipakai sampai 3 tahun.

Pembuatan campuran untuk pewarnaan Giemsa:

A. Penge n ceran 5% (1:20)
    1.   Ambil 0.5 ml cairan Giemsa Stokr
    2.   Tambahka n 9.5 ml air mineral dan campuran ini siap  dig una kan untuk pewarnaan.
    3.   Lama perendama n  untuk pengencer an 5% ini adalah 45 menit.

B. Pengenceran 10% (1:10)
    1.   Ambil 1 ml cairan Giemsa Stok
    2.   Tambahka n 9 ml air  mineral d an campuran ini siap  dig una kan unt uk pewarnaan.
    3.   Lama perendama n  untuk pengencer an 10% ini adalah 25 menit.

C. Pengenceran 20% ( 1:5)
    1.   Ambil 2 ml cairan Giemsa Stok
    2.   Tambahka n 8 ml air  mineral d an campuran ini siap  digunakan untuk
           pewarnaan.
    3.   Lama perendaman untuk pengenceran 20% ini adalah 15 menit.

Fiksasi
a)   Pastikan bahwa slide  sudah kering dengan  sempur na. Sediaan
      darah tebal TIDAK BOLEH  difiksasi.
 b)   Sediaan darah tipis harus difiksasi dengan methanol absolut sebelum di warnai.
       Pegang slide agak miring dengan posi si sediaan darah tipis lebih rendah dan teteskan beberapa tetes            methano l  menggunakan pipet pada sediaan darah tipis ,  biarkan terendam selama 2-3 detik. Cara lain,        khususnya  untuk proses batch deng an  ba nyak sedia an darah darah,  celupkan setiap slide ke dalam          kontainer berisi methanol sebentar saja  (1 sampai  2 detik s aja!) dengan posisi s ediaan darah tipis              dibawah.Methanol tidak boleh mengenai sediaan dar ah teba l.  

Catatan Prosedur

1.   Hati-hati agar tidak memfiksasi  sediaan darah tebal dengan methano l . Hindari juga "fiksasi" sediaan darah t ebal dari uap methano l , jadi pr oses fiksasi sediaan dara h ti pis haru s di lak u kan denga n  hat i -hat i dan cepat.


Pewarnaan / Staining

Biarkan se diaan darah tipis kering  sempurna (kurang lebi h 1 menit)
dengan  meletakkan slide pada po sisi vertikal  dimana sediaan darah tebal
berada di atas. Kontaminasi methanol dala m campuran pewarna akan
menggangangu dehemoglobin fiksasi sediaan darah teba l.

Pewarnaan sistim tetes:
  a)   Siapkan cairan Giemsa 10% baru (pH 7.2).
  b)   Letakkan slide di rak pewarnaan dan teteskan cairan Giemsa mengguna kan pipet sampai selur uh                 sediaan dara h te bal dan tipis tertutup  cairan tersebut.  
  c)   Diamkan selama 25 menit,  jauhkan dari  sinar matahari .
  d)   Bilas perlahan dan hati-hati dengan  air  bersih.
  e)   Biarkan sli d e mengering dengan   posisi berdiri (posisi sediaan darah tebal di bawah). Lindungi slide             dari serangga dan debu.